刘 勇 作者单位：300060 天津，天津医科大学肿瘤医院胃部肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心 液体活检是体外诊断的一个分支，是一种非侵入式的血液检测方法[4]。现有的液体活检技术主要包括循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)以及外泌体检测[5]。ctDNA是指肿瘤细胞脱落或者凋亡后释放进入循环系统中的一类DNA，是肿瘤细胞的一种特征性的生物标志物。ctDNA中还含有其他肿瘤部位释放到血液中的游离DNA，如肿瘤转移部位、克隆性造血体细胞等，ctDNA检测结果提供的是患者体内肿瘤的全景数据，所以在肿瘤晚期发生转移时应用ctDNA检测具有可行性高、数据全、效果好等优点，在癌症临床检测中具有广泛的应用潜力[6-7]。在本文中，我们主要讨论了ctDNA在肿瘤筛查和治疗中的临床应用及其面临的一些问题。 ctDNA是血液中肿瘤衍生的片段化DNA。ctDNA直接来自肿瘤或来自循环肿瘤细胞，其主要由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，存在于血浆或血清中[8]。ctDNA中常包含突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常以及甲基化等相关突变信息[9]。健康人中ctDNA的水平仅以低水平存在，但在癌症患者体内可以检测到更高水平的ctDNA[10]。目前关于ctDNA释放的确切机制尚不明确。
目前，癌症是危害人类健康的疾病之一。2020年，美国预计将会有1 806 590例癌症新发病例和606 520例死亡病例[1]。研究人员一直在寻求可以通过筛查、判断预后结果和监测疗效来检测和治疗癌症的方法。然而，目前已知的诊断方法在癌症检测过程中有的可能会对患者的身体健康产生一定程度的影响，如放射学[2]；有的检测效率较低，如超声波扫描和磁共振成像(MRI)扫描等方法；有的是侵入性的，如组织活检，且该方法存在一定的局限性[3]。因此，迫切需要开发用于癌症筛查、预后以及治疗的非侵入性和较准确的方式。
1 ctDNA
2 ctDNA检测方法
2.1 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR(qPCR)是一种传统的ctDNA检测技术，已被广泛运用于医学检测相关领域[11]。Spindler等[12]利用qPCR定量分析了转移性结直肠癌患者在接受西妥昔单抗和伊立替康治疗期间血浆中cfDNA以及KRAS和BRAF突变的信息。该方法操作简便、数据分析比较容易，且检测费用低廉。但是该方法突变检测限约为0.5%，而且只能检测有限的基因位点信息，不能检测未知序列。所以在ctDNA的相关检测中具有一定的局限性。
2.2 微滴式数字PCR
微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)系统是第三代PCR技术。其在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，不需要标准品和标准曲线便可以实现绝对定量，突变检测限约为0.01%。该方法只需要很少的模板量便可实现分析，与第二代PCR技术相比，该技术可以精确测定基因拷贝数、实现定性和定量分析痕量突变[13-14]。ddPCR满足了更多临床检验的需求，特别是检测一些稀有样本中的核酸信息。Taly等[15]利用双重dPCR检测结直肠癌患者血液中KRAS和BRAF突变信息。Gevensleben等[16]使用dPCR检测了乳腺癌患者中HER2的拷贝数，测定的阳性预测值为70%，阴性预测值为92%。该方法的缺点是同样只能检测到有限的基因位点信息。
2.3 新一代基因测序
新一代基因测序(Next Generation Sequencing, NGS)技术因其通量高、成本较低等优点，目前被广泛应用于血浆DNA的分析中。根据检测过程中的实验方法和检测目的不同，NGS技术在医学领域内的应用主要分为两个方面：一是目标区域捕获测序，该方法通过设计合适的芯片和探针，便可实现对多个已知致病基因的测序分析。Shu等[17]通过靶向新一代测序技术分析了ctDNA突变，为多种类型癌症的个性化治疗提供指导。Hou等[18]基于新一代测序技术检测晚期非小细胞肺癌患者体内的ctDNA，发现了可靶向的遗传变异信息。该方法敏感度较高，而且较其他NGS技术便宜。虽然该方法没有其他NGS方法的检测结果全面，但是比较适用于有明确致病基因或易感基因的疾病。二是全外显子组或全基因组测序。人全基因组重测序是对人类的不同个体或者是群体进行全基因组测序和生物信息学分析。Heitzer等[19]通过全基因组测序可以分析前列腺癌患者循环体系内与肿瘤相关基因的拷贝数变化，也可以检测癌症患者循环体系中的染色体变异情况[20]。人全外显子组测序是指将全基因组外显子区域的DNA进行捕获富集后，利用高通量测序技术进行测序的分析方法[21]。这两种方法应用范围广泛，不受个体的限制，但是费用较高，且敏感度较低。
3 ctDNA在肿瘤中的临床应用
通过检测ctDNA，可以获得血液中肿瘤的相关踪迹信息。ctDNA已成为一类新的肿瘤标志物，在肿瘤的筛查、预后以及治疗等各方面发挥着重要的作用。
3.1 ctDNA与肿瘤筛查
在肿瘤预测与筛查中，ctDNA已被作为液体活检中的一种新型生物标志物。Gao等[22]基于30例晚期胃癌患者的ctDNA和原发肿瘤的突变信息进行了研究，发现基于ctDNA的分析可以部分性地克服肿瘤的异质性，并可能成为胃癌中HER2基因分析的潜在替代指标。Bettegowda等[23]对640名不同类型的癌症患者进行了研究，结果显示有75%的晚期胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃-食管癌患者体内均可检测到ctDNA。该研究结果表明ctDNA是一种适用范围广、敏感度高且具有特异性的生物标志物，可用于多种类型癌症患者的临床诊断。另有相关研究表明，在一些癌症患者体内，ctDNA的平均水平高于健康者。如Park等[24]通过比较54例胃癌患者和59例年龄相匹配的健康者血浆中ctDNA的信息发现患者组血浆ctDNA平均水平比对照组高2.4倍，表明血浆中的ctDNA水平可用于筛查胃癌患者。
ctDNA内基因突变和异常甲基化也成为肿瘤预测和筛查的指标。例如在结直肠癌患者体内常见的基因突变包括KRAS和BRAF V600E[25]。与基因突变相比，特定启动子区域的异常DNA甲基化在ctDNA和肿瘤组织内一致性更高。DNA甲基化是结直肠癌发生的早期现象，已有研究分析了使用甲基化的ctDNA进行结直肠癌筛查和诊断。Herbst等[26]利用甲基化特异性qPCR分析了健康个体和结直肠癌患者血清中10个标记基因的甲基化信息，发现NEUROG1基因的甲基化经常在结直肠癌患者的血清中发现，并且与肿瘤分期无关。结果表明定量检测血清中NEUROG1 DNA甲基化是一种筛查无症状结直肠癌的非侵入性方法。另外，Warren等[27]发现SEPT9甲基化检测法对结直肠癌患者的总体敏感度为90%(95%CI: 77.4%~96.3%)，特异性为88%(95%CI: 79.6%~93.7%)，可以检测所有阶段的结直肠癌患者，可作为筛查结直肠癌的生物标志物，适用于那些不愿意或不能进行结肠镜检查的结直肠癌患者。
3.2 ctDNA与肿瘤治疗
大量研究表明，治疗后肿瘤患者血浆中ctDNA的水平出现下降趋势。因此，ctDNA可作为监测放疗和化疗以及手术切除效果的生物标志物[28]。Diehl等[29]发现所有结直肠癌患者血液样本内手术前均可检测到ctDNA，连续血液采样显示ctDNA水平的变化与手术切除的程度相关。在该研究中，ctDNA(100%)水平检测是比CEA(56%)更可靠和敏感的术后监测指标。Reinert等[28]发现通过ctDNA检测结直肠癌患者术后复发时间比常规随访提前了2~15月(平均10月)，且体检结构变异在监测术后复发方面的敏感度和特异性均为100%。
然而，有研究却发现治疗后肿瘤患者血浆ctDNA浓度的增加也是某些病例治疗成功的指标。增加的ctDNA水平反映了细胞死亡的增加，这反过来表明了治疗的有效性[30]。
ctDNA的早期变化与后期治疗过程中肿瘤的反应相关，并且连续的ctDNA检测具有更显著的应用潜力，可补充到基于实体瘤的疾病评估标准中。Tie等[31]募集了53名接受一线化疗的转移性结直肠癌患者，并探索了ctDNA水平的早期变化，研究发现ctDNA可在大部分初治转移性结直肠癌患者中检测到。在第2周期治疗前观察到ctDNA显著降低(P < 0.001)，通过放射成像观察到ctDNA水平的倍数变化与肿瘤体积的百分比变化呈正相关(P=0.016)。研究结果说明一线化疗期间ctDNA的早期变化预示着后期的放射学反应。
除了监测ctDNA水平的动态变化之外，分析ctDNA中癌症特异性生物标志物的变化模式可以作为预测和监测癌症治疗反应的早期定量指标。Wang等[32]研究表明ctDNA中HER2拷贝数的变化可有效监测曲妥珠单抗的疗效，其功效优于常用的标志物CEA和CA199。
3.3 ctDNA与肿瘤预后
ctDNA在肿瘤预后中也具有很高的价值。研究发现，ctDNA可能是与较差治疗结果相关的可靠预后因素。ctDNA的阳性检测意味着肿瘤患者在接受手术、化疗、放疗或靶向治疗后，复发风险高或总生存期短。Ling等[33]发现胃癌患者血清中的XAF1甲基化与较差的预后显著相关(P < 0.001)。此外，术后胃癌患者血清中XAF1甲基化从阴性到阳性的转变与肿瘤复发密切相关。检测血清中循环甲基化DNA XAF1可评估胃癌患者的预后和复发情况。
另外，研究发现TAC1和SEPT9甲基化增量的动态变化可独立地预测结直肠癌的复发(在所有测试中P < 0.05)。更重要的是，与同时期的血清中癌胚抗原(CEA)相比，随访患者血液内术后6月TAC1和术后一年SEPT9能更早地表现出复发的可能性。因此，在结直肠癌患者的术后血清中检测到的TAC1和SEPT9甲基化水平有望成为新的预后标志物，并且可能被用于监测结直肠癌的复发[34]。
通过检测ctDNA也可以确定复发风险最高的患者，找出后期辅助治疗的方法。Tie等[35]研究发现在接受化疗的患者中，化疗结束后ctDNA的存在与较低的无复发生存期相关(风险比为11; 95%CI: 1.8~68; P=0.001）)Ⅱ期结肠癌切除术后的ctDNA检测提供了残留疾病的直接证据，并确定了复发风险非常高的患者。
4 ctDNA在临床应用中的挑战
ctDNA作为一种新的肿瘤标志物，其在肿瘤的筛查、预后以及治疗等多个方面的应用越来越广泛，特别是对于那些临床症状不典型、检查无特异性以及不能进行组织活检的肿瘤患者。随着肿瘤分子生物学研究和ctDNA相关检测技术的不断发展，ctDNA的相关检测势必会成为临床肿瘤筛查、预后判断和治疗等过程中一项重要检测手段。
然而，目前ctDNA检测技术仍面临着一些需要克服的难题。针对不同种类及不同时期的肿瘤，并没有样本采集、ctDNA提取以及扩增的标准流程。在已发表的相关文献内并未有详细的介绍，且不同文献得到的ctDNA浓度也有所差异。通常体液中ctDNA会被巨噬细胞实时清除掉，从而导致含量极低，且在炎性反应和药物刺激时，人体正常细胞的DNA也会对ctDNA产生干扰。而且目前大多数ctDNA研究集中于具有相对高浓度ctDNA的晚期癌症，缺乏早期癌症和低浓度ctDNA的详细经验。
ctDNA检测会出现一定程度的假阴性和假阳性问题。主要原因是肿瘤的异质性，原发肿瘤、转移性肿瘤、ctDNA三者之间存在差异。而且在肿瘤组织和ctDNA检测标准不一致，比如是否包含驱动基因，是否排除拷贝数变异(copy number variations, CNVs)，这些原因导致不同研究给出的一致性数据相差很多，而且样本采集运输、实验过程规范与否、基因检测不同仪器、生物信息分析软件、生物学因素对肿瘤组织和ctDNA检测都会产生影响。此外ctDNA在此阶段依然不成熟，ctDNA检测下限、不同突变类型的最佳检测下限和不同用途对应的处理过程等，这些因素都可能导致了一些检测的差异存在。
此外，目前ctDNA尚处于小范围测试，不同研究文献得到的结果还存在些许差异，需要进行大量的实验、详细的数据分析，从而证明ctDNA作为肿瘤临床生物标志物的可靠性。而且ctDNA技术作为一项新兴的无创检测技术，临床检测费用昂贵，这也是制约该项技术大规模推广的原因之一。
5 总结
ctDNA检测具有便于动态监测，能完整地反映肿瘤基因信息，克服单一病灶取样的空间限制等优势，为不易做穿刺手术取样的患者，提供了肿瘤基因检测的途径，也为术后肿瘤复发监控提供了方便渠道。现阶段需要完善ctDNA检测的业界标准，细化取样时间、取样部位等操作细则，还需要研究生物学等因素对肿瘤释放到血液中ctDNA含量的影响，以及标准化的实验流程和对应的生物信息分析流程等。